Экспрессия гена P450-монооксигеназы гриба Curvularia sp. в бактериях Escherichia coli и подтверждение функции 7-гидроксилирования

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Разнообразие и уникальность грибных цитохромов Р450 (CYP), способных катализировать регио- и стереоспецифическое гидроксилирование стероидов, делает их важным объектом в области микробиологического синтеза ценных гидроксистероидов. В ходе настоящей работы изучена функция рекомбинантной грибной P450 монооксигеназы (CYPI) штамма Curvularia sp. ВКМ F-3040 — перспективного биокатализатора реакции 7-гидроксилирования стероидов андростанового ряда. Осуществлена ОТ-ПЦР амплификация кДНК последовательностей кандидатного гена CYPI и гена его природного редокс партнера (POR), их клонирование и гетерологическая экспрессия в клетках Escherichia coli BL 21 DE(3). В экспериментах in vitro показана способность полученной рекомбинантной монооксигеназы катализировать гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положениях 7α и 7β. Полученные результаты расширяют знания о грибных стероидных гидроксилазах и открывают перспективы синтеза ценных 7-гидроксистероидов с использованием рекомбинантных продуцентов.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

В. В. Коллеров

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Автор, ответственный за переписку.
Email: svkollerov@rambler.ru
Россия, Пущино, 142290, Московская обл.

C. В. Тарлачков

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Email: svkollerov@rambler.ru
Россия, Пущино, 142290, Московская обл.

А. А. Шутов

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Email: svkollerov@rambler.ru
Россия, Пущино, 142290, Московская обл.

М. В. Донова

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Email: svkollerov@rambler.ru
Россия, Пущино, 142290, Московская обл.

Список литературы

  1. Kristan K., Rižner T.L. Steroid-transforming enzymes in fungi // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2012. V. 129. P. 79–91.
  2. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2011.08.012
  3. Nassiri-Koopaei N., Faramarzi M.A. Recent developments in the fungal transformation of steroids // Biocatal. Biotransform. 2015. V. 33. P. 1–28.
  4. https://doi.org/10.3109/10242422.2015.1022533
  5. Kollerov V., Shutov A., Kazantsev A., Donova M. Biotransformation of androstenedione and androstadienedione by selected Ascomycota and Zygomycota fungal strains // Phytochem. 2020. V. 169. Art. 112160. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2019.112160
  6. Kollerov V., Shutov A., Kazantsev A., Donova M. Steroid modification by filamentous fungus Drechslera sp.: Focus on 7-hydroxylase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activities // Fungal Biol. 2022. V. 126. P. 91‒100.
  7. https://doi.org/10.1016/j.funbio.2021.11.002
  8. Kollerov V.V., Tarlachkov S.V., Donova M.V. De novo transcriptome assembly of Curvularia sp. VKM F-3040, a promising steroid-modifying ascomycete // Microbiol. Resour. Announc. 2023.
  9. https://doi.org/10.1128/MRA.00663-23
  10. Črešnar B., Petrič Š. Cytochrome P450 enzymes in the fungal kingdom // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1814. P. 29–35.
  11. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2010.06.020
  12. Sánchez-Rodríguez A., Portal O., Rojas L.E., Ocaña B., Mendoza M., Acosta M., Jiménez E., Höfte M. An efficient method for the extraction of high-quality fungal total RNA to study the Mycosphaerella fijiensis-Musa spp. interaction // Mol. Biotechnol. 2008. V. 40. P. 299‒305.
  13. https://doi.org/10.1007/s12033-008-9092-1
  14. Lu W., Feng J., Chen X., Bao Y.J., Wang Y., Wu Q., Ma Y., Zhu D. Distinct regioselectivity of fungal P450 enzymes for steroidal hydroxylation // Appl. Environ. Microbiol. 2019. V. 85. Art. e01182–19.
  15. https://doi.org/10.1128/AEM.01182-19

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Визуализация ПЦР-продуктов генов CYPI (а) и POR (б), амплифицированных с использованием в качестве матрицы первой цепи кДНК и рекомбинантной плазмиды pET-22b(+)-CYPI (в) и pET-22b(+)-POR (г) после обработки эндонуклеазами рестрикции NdeI/NotI и EcoRI/NotI, соответственно; гель-электрофорез на 0.8% агарозе (120 В; 40 мин) с окрашиванием этидиум бромидом; М — ДНК маркер (~0.5 мкг).

Скачать (95KB)
Метаданные
3. Рис. 2. ТСХ профиль образцов трансформационной жидкости биоконверсии ДГЭА (0.1 г/л) осадком R20 000 (варианты 1, 3) и супернатантом S20 000 (варианты 2, 4), полученными из гомогената разрушенных рекомбинантных клеток E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+), несущих пустой вектор (варианты 1, 2) и гомогената разрушенных рекомбинантных клеток E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+)-CYPI и E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+)-POR, несущих целевые гены CYPI и POR, соответственно (варианты 3, 4) (72 ч трансформации); С ‒ смесь стандартных стероидов в точке (сверху вниз): ДГЭА (2 мкг), андростендиол (3 мкг), 7β-OH-ДГЭА (2 мкг), 7α-ОН-ДГЭА (2 мкг) (а); Сравнительный ВЭЖХ анализ соединений I и II с контрольными образцами 7β-ОН-ДГЭА (б) и 7α-ОН-ДГЭА (в).

Скачать (171KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024