Влияние неструктурированных участков на экспрессию TIR-доменов Toll-подобных рецепторов в растворимом виде

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Исследовано влияние С-концевого региона на растворимость TIR-доменов TLR4 и TLR10 при гетерологической экспрессии в клетках Escherichia coli. Показано, что отсутствие этого неструктурированного участка существенно увеличивает накопление глобулярных доменов в растворимой форме. Полученные данные дополняют предложенные ранее протоколы получения TIR-доменов семейства TLR для проведения структурных исследований, в том числе методом ЯМР-спектроскопии.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

В. А. Лушпа

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: ms.goncharuk@gmail.com
Россия, 117997 Москва, улица Миклухо-Маклая, 16/10

М. В. Гончарук

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: ms.goncharuk@gmail.com
Россия, 117997 Москва, улица Миклухо-Маклая, 16/10

А. С. Арсеньев

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: ms.goncharuk@gmail.com
Россия, 117997 Москва, улица Миклухо-Маклая, 16/10

К. С. Минеев

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН; Институт органической химии и химической биологии, Университет Гёте во Франкфурте

Email: ms.goncharuk@gmail.com
Россия, 117997 Москва, улица Миклухо-Маклая, 16/10; Германия, 60438 Франкфурт-на-Майне, Макс-фон-Лауэ-Штрассе, 9

С. А. Гончарук

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ms.goncharuk@gmail.com
Россия, 117997 Москва, улица Миклухо-Маклая, 16/10

Список литературы

  1. Medzhitov R. // Nat. Rev. Immunol. 2001. V. 1. P. 135–145. https://doi.org/10.1038/35100529
  2. Akira S., Takeda K., Kaisho T. // Nat. Immunol. 2001. V. 2. P. 675–680. https://doi.org/10.1038/90609
  3. El-Zayat S., Sibaii H., Mannaa F. // Bull. Natl. Res. Cent. 2019. V. 43. P. 187. https://doi.org/10.1186/s42269-019-0227-2
  4. Duan T., Du Y., Xing C., Wang H., Wang R. // Front. Immunol. 2022. V. 13. P. 812774. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.812774
  5. Akira S., Takeda K. // Nat. Rev. Immunol. 2004. V. 4. P. 499–511. https://doi.org/10.1038/nri1391
  6. Gay N., Symmons M., Gangloff M., Bryant C. // Nat. Rev. Immunol. 2014. V. 14. P. 546–558. https://doi.org/10.1038/nri3713
  7. Montero V., de Andrés M. // Allergol. Immunopathol. 2009. V. 37. P. 252–263. https://doi.org/10.1016/j.aller.2009.04.004
  8. Lin Y., Verma A., Hodgkinson C. // Curr. Genomics. 2012. V. 13. P. 633–645. https://doi.org/10.2174/138920212803759712
  9. Zhang Y., Liu J., Wang C., Liu J., Lu W. // Front. Immunol. 2021. V. 12. P. 672346. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.672346
  10. Chen Y., Wu K., Wu H. // Int. J. Mol. Sci. 2024. V. 25. P. 5037. https://doi.org/10.3390/ijms25095037
  11. Wang K., Huang H., Zhan Q., Ding H., Li Y. // MedComm. 2024. V. 5. P. e549. https://doi.org/10.1002/mco2.549
  12. Thakur K., Bolshette N., Trandafir C., Jamdade V., Istrate A., Gogoi R., Cucuianu A. // Exp. Hematol. 2015. V. 43. P. 158–167. https://doi.org/10.1016/j.exphem.2014.11.003
  13. Farooq M., Batool M., Kim M., Choi S. // Front. Cell Dev. Biol. 2021. V. 9. P. 756315. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.756315
  14. Ohto U., Shibata T., Tanji H., Ishida H., Krayukhina E., Uchiyama S., Miyake K., Shimizu T. // Nature. 2015. V. 520. P. 702–705. https://doi.org/10.1038/nature14138
  15. Su L., Wang Y., Wang J., Mifune Y., Morin M., Jones B., Moresco E., Boger D., Beutler B., Zhang H. // J. Med. Chem. 2019. V. 62. P. 2938–2949. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.8b01583
  16. Yoon S., Kurnasov O., Natarajan V., Hong M., Gudkov A., Osterman A., Wilson I. // Science. 2012. V. 335. P. 859–864. https://doi.org/10.1126/science.1215584
  17. Park B., Song D., Kim H., Choi B., Lee H., Lee J. // Nature. 2009. V. 458. P. 1191–1195. https://doi.org/10.1038/nature07830
  18. Tanji H., Ohto U., Shibata T., Taoka M., Yamauchi Y., Isobe T., Miyake K., Shimizu T. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2015. V. 22. P. 109–115. https://doi.org/10.1038/nsmb.2943
  19. Jin M., Kim S., Heo J., Lee M., Kim H., Paik S., Lee H., Lee J. // Cell. 2007. V. 130. P. 1071–1082. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.09.008
  20. Kang J., Nan X., Jin M., Youn S., Ryu Y., Mah S., Han S., Lee H., Paik S., Lee J. // Immunity. 2009. V. 31. P. 873–884. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2009.09.018
  21. Kornilov F., Shabalkina A., Lin C., Volynsky P., Kot E., Kayushin A., Lushpa V., Goncharuk M., Arseniev A., Goncharuk S., Wang X., Mineev K. // Nat. Commun. 2023. V. 14. P. 1503. https://doi.org/10.1038/s41467-023-37042-6
  22. Mineev K., Goncharuk S., Goncharuk M., Volynsky P., Novikova E., Aresinev A. // Sci. Rep. 2017. V. 7. P. 1–12. https://doi.org/10.1038/s41598-017-07250-4
  23. Mineev K., Goncharuk S., Arseniev A. // FEBS Lett. 2014. V. 588. P. 3802–3807. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2014.08.031
  24. Jang T., Park H. // J. Mol. Biol. 2014. V. 426. P. 3305–3313. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2014.07.024
  25. Xu Y., Tao X., Shen B., Horng T., Medzhitov R., Manley J., Tong L. // Nature. 2000. V. 408. P. 111–115. https://doi.org/10.1038/35040600
  26. Nyman T., Stenmark P., Flodin S., Johansson I., Hammarström M., Nordlund P. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 11861–11865. https://doi.org/10.1074/jbc.C800001200
  27. Lushpa V., Goncharuk M., Lin C., Zalevsky A., Talyzina I., Luginina A., Vakhrameev D., Shevtsov M., Goncharuk S., Arseniev A., Borshchevskiy V., Wang X., Mineev K. // Commun. Biol. 2021. V. 4. P. 1–12. https://doi.org/10.1038/s42003-021-02532-0
  28. Lushpa V., Goncharuk M., Talyzina I., Arseniev A., Bocharov E., Mineev K., Goncharuk S. // PLoS One. 2024. V. 19. P. e0304997. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0304997
  29. Jumper J., Evans R., Pritzel A., Green T., Figurnov M., Ronneberger O., Tunyasuvunakool K., Bates R., Žídek A., Potapenko A., Bridgland A., Meyer C., Kohl S., Ballard A., Cowie A., Romera-Paredes B., Nikolov S., Jain R., Adler J., Back T., Petersen S., Reiman D., Clancy E., Zielinski M., Steinegger M., Pacholska M., Berghammer T., Bodenstein S., Silver D., Vinyals O., Senior A., Kavukcuoglu K., Kohli P., Hassabis D. // Nature. 2021. V. 596. P. 583–589. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2
  30. Goncharuk M., Lushpa V., Goncharuk S., Arseniev A., Mineev K. // Protein. Expr. Purif. 2021. V. 181. P. 105832. https://doi.org/10.1016/j.pep.2021.105832

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Анализ аминокислотных последовательностей и структур белков семейства TLR. (а) – Анализ аминокислотных последовательностей внутриклеточных доменов. Жирным шрифтом выделены аминокислоты, составляющие TIR-домен в соответствии с аннотацией UNIPROT. Сплошным подчеркиванием отмечены С-концевые участки и их размер в аминокислотных остатках (а.о.). Пунктирным подчеркиванием в случае TLR10 указана последовательность, описанная в работе Nyman et al. [26]; (б) – структуры внутриклеточных доменов TLR1 (PDB: 7NT7) и TLR4/10 в соответствии с данными AlphaFold2 [29]. Красным цветом выделены TIR-домены, а зеленым и синим – N- и С-концевые участки соответственно.

Скачать (2MB)
Метаданные
3. Рис. 2. Сборка экспрессионных конструкций. Гены, кодирующие TIR-домены рецепторов TLR4 и TLR10 (TLR4-TIR и TLR10-TIR соответственно), амплифицировали методом ПЦР, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции и клонировали в вектор pGEMEX-1, обработанный теми же рестриктазами. TLR4-ICD и TLR10-ICD – гены внутриклеточных доменов TLR4 и TLR10 соответственно, которые кодируют TIR-домены этих белков и прилежащие к ним аминокислотные остатки. H6-GS-TR – последовательность, кодирующая таг из шести гистидинов, гибкого линкера и сайта узнавания тромбина (HHHHHHGSGSGLVPRGS), целевой ген – TLR4-TIR или TLR10-TIR, T7пр – Т7-промотор, T7тер – Т7-терминатор, Ampr – ген устойчивости к ампициллину.

Скачать (619KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Подбор условий культивирования бактериальных штаммов. (а) – Ландшафты экспрессии TLR4-TIR, построенные по методу DOI [28]. Приведена графическая интерпретация влияния концентрации индуктора, температуры и времени культивирования на накопление растворимого TLR4-TIR в клетке. По осям отмечены выход растворимого TLR4-TIR (мг/л минимальной солевой среды М9) и исследуемые параметры: концентрация индуктора, температура или время культивирования. Ландшафты построены для медианных значений параметров: 20°C, 48 ч и 0.05 мМ ИПТГ; (б, г) – подбор оптимальных параметров культивирования бактериальных штаммов при экспрессии TLR10-ICD/TIR (б) и TLR4-ICD/TIR (г). Представлен белковый электрофорез в 14%-ном SDS-ПААГ общего клеточного белка (О) и осветленного клеточного лизата (Р) штаммов, экспрессирующих TLR10-ICD/TIR и TLR4-ICD/TIR. Подвижность полос, соответствующих целевому белку, указана стрелками. Полосы, соответствующие растворимому целевому белку, отмечены звездочками. Результаты представлены для концентрации индуктора 0.05 мМ ИПТГ; (в, д) – выход растворимого (бежевые столбцы) и общего (синие столбцы) белка TLR10-ICD/TIR (в) и TLR4-ICD/TIR (д) при оптимальных условиях культивирования: 28°C, 0.05 мМ ИПТГ, 32 ч для TLR10-ICD, 20°C, 0.05 мМ ИПТГ, 48 ч для TLR10-TIR, 28°C, 0.05 мМ ИПТГ, 24 ч для TLR4-ICD и 25°C, 0.16 мМ ИПТГ, 57 ч для TLR4-TIR. Приведенные выходы (мг/л минимальной солевой среды М9) рассчитаны по интенсивностям полос целевых белков на гель-электрофорезе; n/a – фоновая интенсивность геля (в пустой ячейке). Все эксперименты проведены как минимум в трехкратной повторности, ошибка указана в виде стандартного отклонения. ICD (IntraCellular Domain) – внутриклеточный домен белка (TLR10-ICD или TLR4-ICD), TIR – TIR (Toll-Interleukin-1 Receptor) домен белка (TLR10-TIR или TLR4-TIR).

Скачать (1MB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025