Сравнение эффективности различных промоторов для продукции секретируемой β-маннаназы Bacillus subtilis клетками метилотрофных дрожжей Ogataea haglerorum

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Сильные и строго регулируемые промоторы являются мощным инструментом для создания высокопродуктивных штаммов-продуцентов рекомбинантных белков. Чтобы расширить потенциал системы экспрессии Ogataea haglerorum, природные метанол-индуцируемые промоторы генов OhMOX и OhFMD и конститутивный промотор гена OhGAP были изучены в сравнении с промотором гена OpMOX из дрожжей O. polymorpha. В качестве репортерного использовали ген MANS, кодирующий рекомбинантную β-маннаназу. При культивировании трансформантов O. haglerorum, содержащих ген MANS под контролем промоторов pOhMOX, pOhFMD, pOhGAP из O. haglerorum и pOpMOX из O. polymorpha, активность β-маннаназы в супернатанте составила 170, 93, 89 и 100% соответственно. По результатам ПЦР в реальном времени в клетках дрожжей O. haglerorum промотор pOhMOX обеспечивал более высокий уровень экспрессии гена MANS, чем промотор pOpMOX из дрожжей O. polymorpha. Полученные сведения о силе промоторов из дрожжей O. haglerorum могут быть полезны при конструировании продуцентов рекомбинантных белков и оптимизации путей метаболизма в дрожжах O. haglerorum.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Д. А. Подплетнев

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Email: m_tarutina@mail.ru
Россия, Москва, 123182

А. Р. Лаптева

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Email: m_tarutina@mail.ru
Россия, Москва, 123182

С. П. Синеокий

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Email: m_tarutina@mail.ru
Россия, Москва, 123182

М. Г. Тарутина

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Автор, ответственный за переписку.
Email: m_tarutina@mail.ru

Курчатовский геномный центр

Россия, Москва, 123182

Список литературы

  1. Abdel-Banat B.M.A., Hoshida H., Ano A., Nonklang S., Akada R. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 85. P. 861–867. https://doi.org/10.1007/s00253-009-2248-5
  2. Gödecke S., Eckart M., Janowicz Z. A., Hollenberg C. P. // Gene. 1994. V. 139. № 1. P. 35–42. https://doi.org/10.1016/0378-1119(94)90520-7
  3. Xu X., Ren S., Chen X., Ge J., Xu Z., Huang H. et al. // Virologica Sinica. 2014. V. 29. P. 403–409. https://doi.org/10.1007/s12250-014-3508-9.
  4. Bredell H., Smith J. J., Prins W. A., Gorgens J. F., van Zyl W. H. // FEMS Yeast Research. 2016. V. 16. № 2. https://doi.org/10.1093/femsyr/fow001.
  5. Bredell H., Smith J. J., Gorgens J. F., van Zyl W. H. // Yeast. 2018. V. 35. № 9. P. 519–529. https://doi.org/10.1002/yea.3318.
  6. Youn J. K., Shang L., Kim M. I., Jeong C. M., Chang H. N., Hahm M. S. et al. // J. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 20. № 11. P. 1534–1538. https://doi.org/10.4014/jmb.0909.09046
  7. Gellissen G., Janowicz Z. A., Merckelbach A., Piontek M., Keup P., Weydemann U. et al. // Bio/Technology. 1991. V. 9. № 3. P. 291–295. https://doi.org/10.1038/nbt0391-291
  8. Mayer A. F., Hellmuth K., Schlieker H., Lopez-Ulibarri R., Oertel S., Dahlems U. et al. // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 63. № 3. P. 373–381. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0290(19990505)63:3<373:: aid-bit14>3.0.co;2-t
  9. Smale S. T., Kadonaga J. T. // Annu. Rev. Biochem. 2003. Vol. 72. № 1. P. 449–479. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.72.121801.161520
  10. Portela R. M. C., Vogl T., Kniely C., Fischer J. E., Oliveira R., Glieder A. // ACS Synth. Biol. 2017. V. 6. № . 3. P. 471–484. https://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00178
  11. Bar-Ziv R., Brodsky S., Chapal M., Barkai N. // Cell Rep. 2020. V. 30. № 12. P. 3989–3995. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.02.114
  12. Lin-Cereghino G. P., Godfrey L., de la Cruz B. J., Johnson S., Khuongsathiene S., Tolstorukov I. et al. // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 3. P. 883–897. https://doi.org/10.1128/MCB.26.3.883-897.2006.
  13. Wang X. Wang Q., Wang J., Bai P., Shi L., Shen W., Ca M. // J. Biol. Chem. 2016. V. 291. № 12. P. 6245–6261. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.692053.
  14. Kranthi B. V., Kumar R., Kumar N. V., Rao D. N., Rangarajan P. N. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1789. № 6–8. P. 460–468. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2009.05.004
  15. Waterham H. R., Digan M. E., Koutz P. J., Lair S. V., Cregg V. // Gene. 1997. V. 186. № 1. P. 37–44. https://doi.org/10.1016/s0378-1119(96)00675-0
  16. Harnpicharnchai P., Promdonkoy P., Sae-Tang K., Roongsawang N., Tanapongpipat S. // Ann. Microbiol. 2014. V. 64. P. 1457–1462. https://doi.org/10.1007/s13213-013-0765-z
  17. Heo J. H., Hong W. K., Cho E. Y., Kim M. W., Kim J. Y., Kim C. H. et al. // FEMS Yeast Res. 2003. V. 4. № 2. P. 175–184. https://doi.org/10.1016/S1567-1356(03)00150-8
  18. Naumov G. I., Naumova E. S., Lee C. F. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017. V. 67. № 7. P. 2465–2469. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.002012.
  19. Тарутина М. Г., Каширская М. Д., Лазарева М. Н., Лаптева А. Р., Синеокий С.П // Биотехнология. 2019. Т. 35. № 6. С. 51–56.
  20. Патент РФ. 2022. № RU2764793 C1.
  21. Патент РФ. 2022. № RU2785901 C1.
  22. Sambrook J., Russell D. W. Molecular Сloning a Laboratory Manual. / Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
  23. Saraya R., Gidijala L., Veenhuis M., van der Klei I. J. // Methods Mol. Biol. 2014. P. 43–62. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0563-8_3
  24. Miller G. L. // Anal. Chem. 1959. V. 31. № 3. P. 426–428. https://doi.org/10.1021/ac60147a030
  25. Livak K. J., Schmittgen T. D. // Methods. 2001. V. 25. № 4. P. 402–408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
  26. Promdonkoy P., Tirasophon W., Roongsawang N., Eurwilaichitr L., Tanapongpipat S. // Curr. Microbiol. 2014. V. 69. P. 143–148. https://doi.org/10.1007/s00284-014-0568-x
  27. Pereira G. G., Hollenberg C. P. // Eur. J. Biochem. 1996. V. 238. № 1. P. 181–191. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1996.0181q.x.
  28. Roggenkamp R., Hansen H., Eckart M., Janowicz Z., Hollenberg C. P. // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 202. P. 302–308. https://doi.org/10.1099/00221287-132-12-3459
  29. Bogdanova A. I., Agaphonov M. O., Ter-Avanesyan M. D. // Yeast. 1995. V. 11. № 4. P. 343–353. https://doi.org/10.1002/yea.320110407
  30. Kim S. Y., Sohn J.-H., Bae J.-H., Pyun Y.-R., Agaphonov M. O., Ter-Avanesyan M.D., Choi E. S. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 8. P. 4448–4454. https://doi.org/10.1128/AEM.69.8.4448-4454.2003
  31. Amuel C., Gellissen G., Hollenberg C. P., Suckow M. // Biotechnol. Bioprocess Eng. 2000. V. 5. P. 247–252. https://doi.org/10.1007/BF02942181
  32. Suppi S., Michelson T., Viigand K., Alamae T. // FEMS Yeast Res. 2013. V. 13. № 2. P. 219–232. https://doi.org/10.1111/1567-1364.12023
  33. Yan C., Yu W., Yao L., Guo X., Zhou Y. J., Gao J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2022. V. 106. № 9–10. P. 3449–3464. https://doi.org/10.1007/s00253-022-11948-5

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема экспрессионного вектора pOpMOX-Km (а) и плазмиды pOhMOX-MANS-HARS (б). Промоторы pOhFMD, pOhGAP и pOpMOX содержат плазмиды pOhFMD-MANS-HARS (7986 п. н.), pOhGAP-MANS-HARS (8091 п. н.) и pOpMOX-MANS-HARS (7993 п. н.) соответственно.

Скачать (197KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Последовательность, локализованная перед ATG кодоном гена OhMOX. Подчеркиванием выделена область между открытыми рамками считывания соседних генов. Предполагаемые последовательности URS (upstream repressing sequence), UAS1, UAS2 (upstream activator sequences) и TATA-box выделены жирным шрифтом. Предполагаемый сайт связывания с core-последовательностью CYCC гомолога Mrx1 выделен курсивом и жирным шрифтом. Стартовый кодон открытой рамки считывания для метанолоксидазы (ATG) выделен жирным шрифтом. Местоположение отсутствующего участка размером 22 п. н. обозначено ломаной линией.

Скачать (519KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Уровень активности маннаназы (ед./мл) в образцах с геном MANS под контролем промоторов: 1 — pOpMOX; 2 — pOhGAP; 3 — pOhFMD; 4 — pOhMOX. Пределы погрешностей показывают стандартное отклонение среднего значения активности 12 трансформантов. p < 0.05, ns — несущественное различие.

Скачать (81KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Электрофорез в ПААГ с ДДС-Na рекомбинантной β-маннаназы, секретированной трансформантами O. haglerorum, содержащими плазмиды с промоторами pOhMOX, pOpMOX, pOhFMD и pOhGAP. 1, 7 — маркер молекулярной массы, кДа, 2 — pOhMOX, 3 — pOpMOX, 4 — pOhFMD; 5 — pOhGAP; 6 — образец с промотором pOpMOX в условиях без индукции.

Скачать (83KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Относительный уровень транскрипции гена MANS (%), находящегося под контролем промоторов pOhMOX (II) или pOpMOX (I). Показан средний уровень транскрипции гена MANS в 6 трансформантах с каждым из промоторов при культивировании в среде с метанолом в течение 12 (1) и 20 ч (2). Уровень транскрипции гена MANS под контролем pOpMOX через 12 ч индукции принят за 100%. Пределы погрешностей показывают стандартное отклонение для трех независимых экспериментов, p < 0.05.

Скачать (81KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024