Молекулярное маркирование в селекции капусты белокочанной на устойчивость к альтернариозу
- Авторы: Дубина Е.В.1,2, Макуха Ю.А.1, Гаркуша С.В.1, Симоненко Д.С.2, Горун О.Л.1, Лесняк С.А.1
-
Учреждения:
- ФГБНУ «Федеральный научный центр риса»
- ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»
- Выпуск: № 2 (2024)
- Страницы: 8-10
- Раздел: Растениеводство и селекция
- URL: https://jdigitaldiagnostics.com/2500-2082/article/view/659338
- DOI: https://doi.org/10.31857/S2500208224020029
- ID: 659338
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В представленном исследовании изучен полиморфизм SSR-локусов по признаку устойчивости капусты белокочанной к альтернариозу. Цель работы – выявить эффективные и информативные SSR-маркеры для идентификации в генотипах гибридных растений культуры донорных аллелей устойчивости к альтернариозу. Из 20 апробированных маркеров только PBCESSRJU13, PBCESSRJU6, NI-F02a демонстрируют аллельную разницу между контрастными по резистентности к альтернариозу изогенными линиями. Они станут основой для последующих исследований по проведению анализа расщепления в сегрегирующих популяциях и определению информативных ДНК-маркерных систем, сонаследуемых с признаком устойчивости капусты белокочанной к альтернариозу.
Ключевые слова
Полный текст
Капуста белокочанная (Brassica oleracea L.) – наиболее востребованная овощная культура среди всех представителей рода Brassica. Ее пищевая ценность объясняется высоким содержанием биологически активных веществ, в том числе, фенольных соединений, выполняющих важные физиологические функции в живом организме, а также биофлавоноидов, которые регулируют многие реакции метаболизма, участвуют в окислительно-восстановительных процессах, обладают широким спектром биологической активности. [2]
Среди деструктивных болезней данной культуры, значительно снижающих урожайность, особое внимание стоит уделить альтернариозу (черная пятнистость), основные возбудители которого – фитопатогенные грибы видов Alternaria brassicae, Alternaria brassicicola. [3] Поражение может происходить на любом этапе развития растения. На стадии сеянцев появляются черные некротические полоски и пятна на семядолях и подсемядольных коленах, что приводит к их увяданию. У более взрослых растений на кроющих листьях кочана есть темные зональные пятна, покрытые рыхлым сажистым налетом спороношения. Пятна часто с желтой окантовкой. Середина их вскоре становится желто-коричневой и впоследствии может выпасть, в результате чего листья приобретают изрешеченный вид. Часто альтернариозом поражаются кочаны капусты, при этом на наружных листьях образуется черный налет, а затем и черные некротические пятна, может возникнуть ранняя дефолиация и гибель растения. [7]
По результатам анализа литературных источников, исследования в области молекулярного маркирования генов (локусы) устойчивости к альтернариозу в основном посвящены представителям масличных культур семейства Brassicaceae (Brassica juncea, Brassica carinata). [4, 5, 8] Работы по определению информативных маркерных систем на данный признак у капусты белокочанной не проводили.
Цель исследования – поиск информативных SSR-маркеров для идентификации в генотипах растений капусты белокочанной донорных аллелей устойчивости к альтернариозу.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект изучения – контрастные формы капусты белокочанной (устойчивая изогенная линия 42 и восприимчивая изогенная линия 32), отобранные в отделе овощекартофелеводства ФГБНУ «ФНЦ риса».
ДНК из листьев капусты выделяли по схеме Мюррея и Томпсона [6] c использованием цетилтриметиламмоний бромида (СТАВ) в качестве лизирующего буфера растительных клеток.
В молекулярно-генетических исследованиях по идентификации аллелей устойчивости к альтернариозу у капусты белокочанной применяли SSR-маркеры. [4, 5, 8] Нуклеотидные последовательности праймеров представлены в таблице.
Нуклеотидная последовательность использованных в исследовании праймеров
Маркер | Последовательность праймеров |
PBCESSRJU1 | F: GGTGAAAGAGGAAGATTGGT R: AGGAGATACAGTTGAAGGGTC |
PBCESSRJU2 | F: TTCACATCTTCTTCATCTTCC R: TTGCTATTCGTTCTCAGTCTC |
PBCESSRJU3 | F: CCTCTTTTAATTCAAACAAGAAATCA R: TTCGGACAATGGCAGTGATA |
PBCESSRJU4 | F: CACCTTATCATCTCTCTATCCC R: CCTCTGTTTCTCTCCTTGTG |
PBCESSRJU5 | F: GGCACGTACATGGAGGATTC R: TGTTGGTCGAGCTGTTTCAG |
PBCESSRJU6 | F: TCTCTCACCTGCCTTGTCT R: ACTCCTCGGTAATGCCTC |
PBCESSRJU7 | F: TACCACTCCCTAACCGCA R: ATCACCTTGAGAGCGAAG |
PBCESSRJU8 | F: CGCTCTTCTTCTTAGTCCTCT R: ACTTCATCTTCACCGCCT |
PBCESSRJU9 | F: CCCTACCGCTGGCTAGACTT R: GCATCATGACCAACTATCAACC |
PBCESSRJU10 | F: GCGGCGTAGGTACTGGAG R: AGCCATCGAGCCATTCAG |
PBCESSRJU11 | F: CGGTGTTAAAAGGGTTATTTC R: ATCTCCAATCAAAAAGCAAAC |
PBCESSRJU12 | F: AAGCTCAGATCGTTTGCG R: AGATGAATGTGAAATAGGGGT |
PBCESSRJU13 | F: TTGCTTTGACTGAGCCTG R: CCATTCATGGAGCCTGTAG |
PBCESSRJU14 | F: GCGAAGCAGTCTGAAACC R: GCGAATCCGGTGAGAAAC |
PBCESSRJU15 | F: GGATCTCATGTTCACTGCTG R: TGATTACATACCAAATATGAG |
PBCESSRJU16 | F: TCCTCACTTTCTTGGCATC R: ACTGAAAAGACCACTACCACCA |
Ni2D10 | F: GATGCCCCAAATCTGTTACG R: CAATTCGTGAAAAATAGCCG |
Ni3C05 | F: TTTCGTGCTTTGGTGTGAAG R: TCCCCAAATCGAACCATAAG |
BRMS-011 | F: GAACGCGCAACAACAAATAGTG R: CGCGTCACAATCGTAGAGAATC |
NI-F02a | F: TGCAACGAAAAAGGATCAGC R: TGCTAATTGAGCAATAGTGATTCC |
Копирование участков ДНК проводили в амплификаторах Терцик и Bio Rad с оптимизацией условий ПЦР. При апробации маркеров использовали протокол: первичная денатурация – 15 мин., следующие 35 циклов: денатурация при 95°С – 60 сек., отжиг праймеров (54°С) – 60 сек., элонгация (72°С) – 60 сек., финальная элонгация (72°С) – 10 мин.
Разделяли продукты амплификации методом электрофореза в 8%-ом полиакриламидном геле (180 мин.) при напряжении 220 В. [1] Визуализировали результаты электрофореза в УФ-свете с помощью гель-документирующей системы GelDocXR+.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В молекулярно-генетических исследованиях по выявлению информативных ДНК-маркерных систем для идентификации аллелей устойчивости к альтернариозу апробировали 20 SSR-маркеров на контрастных по резистентности к альтернариозу изогенных линиях капусты белокочанной, три из которых оказались наиболее полиморфными (рис. 1–3, 4-я стр. обл.).
Рис. 1. Визуализация продуктов ПЦР по локусу PBCESSRJU13 в 8%-ом ПААГ. Мт - маркер молекулярной массы; У - изогенная устойчивая линия 42; Н/У - изогенная неустойчивая линия 32 (то же на рис. 2,3)
Рис. 2. Визуализация продуктов ПЦР по локусу PBCESSRJU6 в 8%-ом ПААГ
Рис. 3. Визуализация продуктов ПЦР по локусу NI-F02a в 8%-ом ПААГ
На рисунке 1 видно, что маркер PBCESSRJU13 выявляет полиморфизм между контрастными по устойчивости к альтернариозу формами капусты белокочанной. С помощью маркера молекулярной массы определен размер ПЦР-продуктов: устойчивые аллели – 408 и 1000 п.н., неустойчивые – 354 и 948 п.н.
На электрофореграммах видна аллельная разница между изучаемыми контрастными формами капусты белокочанной (рис. 2, 3, 4-я стр. обл.). Размер аллелей устойчивости по локусу PBCESSRJU6 – 142, 191, 370 и 432 п.н., аллеля восприимчивости – 318 п.н, по локусу NI-F02a размер обнаруженных ПЦР-продуктов составляет 400, 650 и 975 п.н. (устойчивые), 700 п.н. (неустойчивые).
При апробации остальных 17 маркеров полиморфизма между контрастными изогенными линиями обнаружено не было.
Таким образом, только PBCESSRJU13, PBCESSRJU6, NI-F02a демонстрируют аллельную разницу между контрастными по резистентности к альтернариозу изогенными линиями капусты белокочанной. В последующих исследованиях отобранные маркеры будут взяты для анализа расщепления и изучения их сонаследования с признаком устойчивости к альтернариозу на растениях сегрегирующих популяций.
Об авторах
Елена Викторовна Дубина
ФГБНУ «Федеральный научный центр риса»; ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»
Автор, ответственный за переписку.
Email: lenakrug1@rambler.ru
доктор биологических наук, профессор РАН
Россия, Краснодар; КраснодарЮлия Александровна Макуха
ФГБНУ «Федеральный научный центр риса»
Email: lenakrug1@rambler.ru
кандидат биологических наук
Россия, КраснодарСергей Валентинович Гаркуша
ФГБНУ «Федеральный научный центр риса»
Email: lenakrug1@rambler.ru
член-корреспондент РАН
Россия, КраснодарДмитрий Сергеевич Симоненко
ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»
Email: lenakrug1@rambler.ru
аспирант
Россия, КраснодарОлеся Леонидовна Горун
ФГБНУ «Федеральный научный центр риса»
Email: lenakrug1@rambler.ru
младший научный сотрудник
Россия, КраснодарСергей Александрович Лесняк
ФГБНУ «Федеральный научный центр риса»
Email: lenakrug1@rambler.ru
младший научный сотрудник
Россия, КраснодарСписок литературы
- Кутлунина Н.А., Ермошин А.А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений. Екатеринбург, 2017. 142 с.
- Макуха Ю.А., Дубина Е.В. Разработка методологии оценки устойчивости капусты белокочанной к Xanthomonas campestris с применением SSR-маркеров // Рисоводство. 2019. № 3 (44). С. 27–32.
- Doullah M.A.U., Meah M.B., Okazaki K. Development of an effective screening method for partial resistance to Alternaria brassicicola (dark leaf spot) in Brassica rapa. Eur. J. Plant. Pathol. 2006; 116 (1): 33–43. https://doi.org/10.1007/s10658-006-9035-2
- Ghosh S., Mazumder M., Mondal B. et al. Morphological and SSR marker-based genetic diversity analysis of Indian mustard (Brassica juncea L.) differing in Alternaria brassicicola tolerance. Euphytica. 2019. V. 215. P. 206–224. https://doi.org/10.1007/s10681-019-2523-1
- Hopkins C.J., Cogan N.O.I., Hand M. et al. Sixteen new simple sequence repeat markers from Brassica juncea expressed sequences and their cross-species amplification. Mol. Ecol. Notes. 2007. V. 7 (4). P. 697–700. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2007.01681.x
- Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 1980. V. 10. P. 4321–4325.
- Nowicki M., Nowakowska M., Niezgoda A., Kozik E. Alternaria black spot of crucifers: symptoms, importance of disease, and perspectives of resistance breeding. Veg. Crops Res. Bull. 2012. V. 76 (1). P. 5–19. https://doi.org/10.2478/v10032-012-0001-6
- Pratap P., Thakur A.K., Meena P.D. et al. Genetic diversity assessment in Indian mustard (Brassica juncea L.) for Alternaria black leaf spot tolerance using SSR markers. J. Oilseed Brassica. 2015. V. 6 (1). P. 175–182.
Дополнительные файлы
