Значение мембранных сегментов М6 и М8 в биогенезе и функционировании PМА1 H+-ATФазы дрожжей

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Мембранный домен PMA1 H+-ATФазы плазматической мембраны дрожжей образуют 10 трансмембранных сегментов (M1–M10), из которых сегменты М6 и М8 являются особенно важными. Для их изучения использовали аланин-сканирующий мутагенез, заменяя каждый из остатков, образующих сегменты, на аланин. Ферменты экспрессировали с плазмидного гена pma1 в секреторных везикулах в условиях теплового шока. В M6 в половине случаев мутантные белки теряли активность (0–7%), но были экспрессированы на уровне 15–87% от дикого типа. В М8 у трети мутантов наблюдался блок в биогенезе (0–7%) или значительное снижение экспрессии (до 16–17%), сопровождавшееся почти полной потерей ферментативной активности (0–10%). Поскольку экспрессирование в секреторных везикулах требует использования повышенной температуры, было проверено действие мутаций, вызывающих нарушение экспрессии и АТФазной активности, на биогенез и функционирование фермента в отсутствие теплового шока, для чего экспрессию осуществляли в плазматических мембранах с хромосомного гена РМА1 при пермиссивной температуре. В случае М6 лишь один мутант из десяти неактивных (F728A) был экспрессирован в плазматической мембране и обладал активностью на уровне дикого типа; остальные мутанты были нежизнеспособными. В случае М8 только мутанты Q798A и I799A не были способны экспрессироваться на уровне плазмалеммы, в то время как I794A, F796A, L797A, L801A экспрессировались на 35–89% и обладали активностью 14–65% от уровня дикого типа. Было сравнено влияние мутаций F728A и F796A на структурно-функциональную организацию РМА1 АТФазы и ее регуляцию при глюкозо-зависимой активации фермента. Обе мутации снижали активность АТФазы на 30–50% и степень ее активации на 30–40%. Данные позволяют сделать вывод о том, что замены в сегменте М6 влияют в первую очередь на функционирование фермента и в меньшей степени на его конформацию и биогенез, предполагая участие исследуемых аминокислотных остатков в транспортном процессе. Остатки в М8, наоборот, играют большую роль в биогенезе АТФазы. В целом, результаты подтверждают важную роль аминокислотных остатков в М6 и М8 для структурно-функциональной организации PМА1 H+-АТФазы и указывают на то, что М6 содержит больше остатков, влияющих на функционирование фермента.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

В. В. Петров

Федеральный исследовательский центр “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Автор, ответственный за переписку.
Email: vpetrov07@gmail.com

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина

Россия, 142290, Пущино, Московская обл.

Список литературы

  1. Окороков Л. А., Петров В. В. Выделение везикул плазматических мембран дрожжей Saccharomyces carlsbergensis, пригодных для исследования транспорта веществ // Биол. мембраны. 1986. Т. 3. С. 549–556.
  2. Петров В. В. Точечные мутации в Pma1 Н+-АТРазе дрожжей Saccharomyces cerevisiae: влияние на ее экспрессию и активность // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 1070–1080.
  3. Petrov V. V. Point mutations in Pma1 H+ATPase of Saccharomyces cerevisiae: influence on its expression and activity // Biochemistry (Moscow). 2010. V. 75. P. 1055–1170.
  4. Петров В. В. Роль петли L5-6, соединяющей мембранные сегменты М5 и М6, в биогенезе и функционировании Pma1 Н+-АТРазы дрожжей // Биохимия. 2015. Т. 80. С. 41–58.
  5. Petrov V. V. Role of loop L56 connecting transmembrane segments M5 and M6 in biogenesis and functioning of yeast Pma1 H+ATPase // Biochemistry (Moscow). 2015. V. 80. P. 31–41.
  6. Петров В. В. Влияние мутаций в экстрацитозольном домене H+-АТФазы плазматической мембраны дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ее активность и регуляцию // Микробиология. 2023. Т. 92. С. 329–334.
  7. Petrov V. V. Effect of mutations in the extracytosolic domain of the Saccharomyces cerevisiae H+-ATPase on its activity and regulation // Microbiology (Moscow). 2023. V. 92. P. 468–473.
  8. Ambesi A., Miranda M., Petrov V. V., Slayman C. W. Biogenesis and function of the yeast plasma-membrane H+-ATPase // J. Exp. Biol. 2000. V. 203. P. 156–160.
  9. Andersen J. P., Vilsen B. Amino acids Asn796 and Thr799 of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum bind Ca2+ at different sites // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 15931–15936.
  10. Asano S., Io T., Kimura T., Sakamoto S., Takeguchi N. Alanine-scanning mutagenesis of the sixth transmembrane segment of gastric H+,K+-ATPase alpha-subunit // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 31265–31273.
  11. Axelsen K. B., Palmgren M. G. Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase superfamily // J. Mol. Evol. 1998. V. 46. P. 84–101.
  12. Bensadoun A., Weinstein D. Assay of proteins in the presence of interfering materials // Anal. Biochem. 1976. V. 70. P. 241–250.
  13. Buch-Pedersen M.J., Venema K., Serrano R., Palmgren M. G. Abolishment of proton pumping and accumulation in the E1P conformational state of a plant plasma membrane H+-ATPase by substitution of a conserved aspartyl residue in transmembrane segment 6 // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 39167–39173.
  14. Buch-Pedersen M.J., Palmgren M. G. Conserved Asp684 in transmembrane segment M6 of the plant plasma membrane P-type proton pump AHA2 is molecular determinant of proton translocation // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 17845–17851.
  15. Chang A., Slayman C. W. Maturation of the yeast plasma membrane [H+]ATPase involves phosphorylation during intracellular transport // J. Cell. Biol. 1991. V. 115. P. 289–295.
  16. Ferreira T., Mason A. B., Pypaert M., Allen K. E., Slayman C. W. Quality control in the yeast secretory pathway: a misfolded PMA1 H+-ATPase reveals two checkpoints // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 21027–21040.
  17. Fiske C. H., Subbarow Y. The colorometric determination of phosphorus // J. Biol. Chem. 1925. V. 66. P. 375–400.
  18. Heit S., Geurts M. M.G., Murphy B. J., Corey R. A., Mills D. J., Kühlbrandt W., Bublitz M. Structure of the hexameric fungal plasma membrane proton pump in its autoinhibited state // Sci. Adv. 2021. V. 7. Art. eabj5255. https://doi.org/10.1126/sciadv.abj5255
  19. Hermsen H. P., Koenderink J. B., Swarts H. G.P., De Pont J. J. The negative charge of glutamic acid-795 is essential for gastric H+,K+-ATPase activity // Biochemistry. 1998. V. 39. P. 1330–1337.
  20. Hermsen H. P., Swarts H. G.P., Koenderink J. B., De Pont J. J. The carbonyl group of glutamic acid-820 in the gastric H+,K+-ATPase alpha-subunit is essential for K+ activation of the enzyme activity // Biochem. J. 2000. V. 331. P. 465–472.
  21. Guerra G., Petrov V. V., Allen K. E., Miranda M., Pardo J. P., Slayman C. W. Role of transmembrane segment M8 in the biogenesis and function of yeast plasma-membrane H+-ATPase // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1768. P. 2383–2392.
  22. Jewell-Motz E.A., Lingrel J. B. Site-directed mutagenesis of the Na,K-ATPase: consequences of substitutions of negatively-charged amino acids localized in the transmembrane domains // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 13523–13530.
  23. Kanai R., Ogawa H., Vilsen B., Cornelius F., Toyoshima C. Crystal structure of a Na+-bound Na+,K+-ATPase preceding the E1P state // Nature. 2013. V. 502. P. 201–206.
  24. Kuntzweiler T. A., Arguello J. M., Lingrel J. B. Asp804 and Asp808 in the transmembrane domain of the Na,K-ATPase a subunit are cation coordinating residues // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 29682–29687.
  25. Lecchi S., Allen K. E., Pardo J. P., Mason A. B., Slayman C. W. Conformational changes of yeast plasma membrane H+-ATPase during activation by glucose: role of threonine-912 in the carboxy-terminal tail // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 16624–16632.
  26. Lecchi S., Nelson C. J., Allen K. E., Swaney D. L., Thompson K. L., Coon J. J., Sussman M. R., Slayman C. W. Tandem phosphorylation of Ser-911 and Thr-912 at the C terminus of yeast plasma membrane H+-ATPase leads to glucose-dependent activation // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 35471–35481.
  27. Lutsenko S., Kaplan J. H. Organization of P-type ATPases: significance of structural diversity // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 15607–15613.
  28. Mandal D., Woolf T. B., Rao R. Manganese selectivity of pmr1, the yeast secretory pathway ion pump, is defined by residue Gln783 in transmembrane segment 6. Residue Asp778 is essential for cation transport // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 23933–23938.
  29. Mazon M. J., Eraso P., Portillo F. Specific phosphoantibodies reveal two phosphorylation sites in yeast Pma1 in response to glucose // FEMS Yeast Research. 2015, V. 15, P. 1-9.
  30. Miranda M., Pardo J. P., Petrov V. V. Structure-function relationships in membrane segment 6 of the yeast plasma membrane Pma1 H+-ATPase // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1808. P. 1781–1789.
  31. Morth J. P., Pedersen B. P., Toustrup-Jensen M.S., Sorensen T. L., Petersen J., Andersen J. P., Vilsen B., Nissen P. Crystal structure of the sodium-potassium pump // Nature. 2007. V. 450. P. 1043–1049.
  32. Morsomme P., Slayman C. W., Goffeau A. Mutagenic study of the structure, function and biogenesis of the yeast plasma membrane H+-ATPase // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1469. P. 133–157.
  33. Nakamoto R. K., Rao R., Slayman C. W. Expression of the yeast plasma membrane H+-ATPase in secretory vesicles. A new strategy for directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 7940–7949.
  34. Nielsen J. M., Pedersen P. A., Karlish S. J.D., Jørgensen P. L. Importance of intramembrane carboxylic acids for occlusion of K+ ions at equilibrium in renal Na,K-ATPase // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 1961–1968.
  35. Nyblom M., Poulsen H., Gourdon P., Reinhard L., Andersson M., Lindahl E., Fedosova N., Nissen P. Crystal structure of Na+, K+-ATPase in the Na+-bound state // Science. 2013. V. 342. P. 123–127.
  36. Ogawa H., Shinoda T., Cornelius F., Toyoshima C. Crystal structure of the sodium-potassium pump (Na+,K+-ATPase) with bound potassium and ouabain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 13742–13747.
  37. Pedersen B. P., Buch-Pedersen M., Morth J. J.P., Palmgren M. G., Nissen P. Crystal structure of the plasma membrane proton pump // Nature. 2007. V. 450. P. 1111–1114.
  38. Petrov V. V. Point mutations in the extracytosolic loop between transmembrane segments M5 and M6 of the yeast Pma1 H+-ATPase: alanine-scanning mutagenesis // J. Biomol. Struct. Dyn. 2015. V. 33. P. 70–84.
  39. Petrov V. V., Padmanabha K. P., Nakamoto R. K., Allen K. E., Slayman C. W. Functional role of charged residues in the transmembrane segments of the yeast plasma membrane H+-ATPase // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 15709–15716.
  40. Petrov V. V., Slayman C. W. Site-directed mutagenesis of the yeast PMA1 H+-ATPase. Structural and functional role of cysteine residues // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 28535–28540.
  41. Rice W. J., MacLennan D. H. Scanning mutagenesis reveals a similar pattern of mutation sensitivity in transmembrane sequences M4, M5, and M6, but not in M8, of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum (SERCA1a) // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 31412–31419.
  42. Robles-Martinez L., Pardo J. P., Miranda M., Mendez T. L., Matus-Ortega M.G., Mendoza-Hernandez G., Guerra-Sanchez G. The basidiomycete Ustilago maydis has two plasma membrane H+-ATPases related to fungi and plants // J. Bioenerg. Biomembr. 2013. V. 45. P. 477–490.
  43. Serrano R. In vivo glucose activation of the yeast plasma membrane ATPase // FEBS Lett. 1983. V. 156. P. 11–14.
  44. Shinoda T., Ogawa H., Cornelius F., Toyosima C. Crystal structure of the sodium-potassium pump at 2.4 Å resolution // Nature. 2009. V. 459. P. 446–450.
  45. Syhrova H., Kotyk A. Conditions of activation of yeast plasma membrane ATPase // FEBS Lett. 1985. V. 183. P. 21–24.
  46. Takahashi M., Kondou Y., Toyoshima C. Interdomain communication in calcium pump as revealed in the crystal structures with transmembrane inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 5800–5805.
  47. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4673–4680.
  48. Toyoshima C., Iwasawa S., Ogawa H., Hirata A., Tsueda J., Inesi G. Crystal structures of the calcium pump and sarcolipin in the Mg2+-bound E1 state // Nature. 2013. V. 495. P. 260–264.
  49. Toyosima C., Nakasako M., Nomura H., Ogawa H. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 Å resolution // Nature. 2000. V. 405. P. 647–655.
  50. Toyosima C., Nomura H. Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium // Nature. 2002. V. 418. P. 605–611.
  51. Toyoshima C., Norimatsu Y., Iwasawa S., Tsuda T., Ogawa H. How processing of aspartylphosphate is coupled to lumenal gating of the ion pathway in the calcium pump // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 19831–19836.
  52. Vilsen B., Andersen J. P. Mutation to the glutamate in the fourth membrane segment of Na+,K+-ATPase and Ca2+-ATPase affects cation binding from both sides of the membrane and destabilizes the occluded enzyme forms // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 10961–10971.
  53. Wei Y., Chen J., Rosas G., Tompkins D. A., Holt P. A., Rao R. Phenotypic screening of mutations in Pmr1, the yeast secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase, reveals residues critical for ion selectivity and transport // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 23927–23932.
  54. Young M. R., Heit S., Bublitz M. Structure, function and biogenesis of the fungal proton pump Pma1 // Biochim. Biophys. Acta. 2024. V. 1871. P. 119600.
  55. Zhang Z., Lewis D., Strock C., Inesi G., Nakasako M., Nomura H., Toyoshima C. Detailed characterization of the cooperative mechanism of Ca2+ binding and catalytic activation in the Ca2+ transport (SERCA) ATPase // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 8758–8767.
  56. Zhao P., Zhao C., Chen D., Yun C., Li H., Bai L. Structure and activation mechanism of the hexameric plasma membrane H+-ATPase // Nature Commun. 2021. V. 12. P. 6439–6450.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей трансмембранного сегмента М6 РМА1 Н+-АТФазы дрожжей S. cerevisiae и Н+-АТФаз плазматических мембран различных грибов, водорослей и растений. Жирным шрифтом и серым цветом выделены аминокислотные остатки сегмента М6 РМА1 Н+-АТФазы S. cerevisiae и идентичные им аминокислотные остатки в других АТФазах, жирным шрифтом – гомологичные остатки. Большим размером отмечены Asp-730 и Asp-739.

Скачать (936KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей трансмембранного сегмента М8 РМА1 Н+-АТФазы дрожжей S. cerevisiae и Н+-АТФаз плазматических мембран различных грибов, водорослей и растений. Жирным шрифтом и серым цветом выделены Ile-794, Phe-796, Leu-797, Gln-798, Ile-799, Leu-801, Glu-803, Ile-807 и соответствующие им аминокислотные остатки в других АТФазах, жирным шрифтом – гомологичные остатки. Большим размером отмечен Glu-803.

Скачать (948KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей трансмембранных сегментов М6 и М8 РМА1 Н+-АТФазы S. cerevisiae и Ca2+-, H+,K+- и Na+,K+-АТФаз животных. Жирным шрифтом и серым цветом выделены аминокислотные остатки сегментов М6 и М8 РМА1 Н+-АТФазы S. cerevisiae и идентичные им аминокислотные остатки в других АТФазах, жирным шрифтом – гомологичные остатки. См. также подписи к рис. 1 и 2.

Скачать (245KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025