Влияние криоконсервации и молекулярного водорода на ультраструктуру сперматозоидов быков

Полный текст

Интенсивное использование высокоценных быков-производителей в молочном скотоводстве – важное условие улучшения продуктивности. [4]

Основной метод для сохранения генетического разнообразия и технологии повышения репродуктивного статуса – метод криоконсервации спермы, позволяющий создавать банки спермы, в течение долгого времени сохранять генетический материал для селекции и транспортировать его на большие расстояния. [1]

Главная проблема при криоконсервации спермы – ее качество после оттаивания. В процессе замораживания-оттаивания примерно 50% сперматозоидов погибает. [11]

Глубокое замораживание отрицательно влияет на структуру мембран сперматозоидов, нарушается метаболизм, осмотический баланс клеток, активируются свободнорадикальные процессы. Избыточная выработка активных форм кислорода изменяет физико-химические свойства сперматозоидов, повреждает их ДНК, что приводит к снижению фертильности. Эндогенных антиоксидантов, присутствующих в сперматозоидах крупного рогатого скота, недостаточно для обеспечения целостности клеток после окислительного стресса при криоконсервации. Для повышения жизнеспособности сперматозоидов после размораживания необходимы добавки антиоксидантов. [14]

Молекулярный водород – антиоксидант с широким спектром действия. Он избирательно нейтрализует агрессивные высокотоксичные ОН и ONOO− и не нарушает функционирование сигнальных активных форм кислорода. Это выделяет молекулярный водород из общего количества антиоксидантов, которые не обладают таким действием в отношении свободных радикалов. Таким образом, молекулярный водород может уменьшать окислительный стресс и корректировать окислительно-восстановительный статус клеток. [5, 6, 12]

Обычно сперму изучают с помощью световой микроскопии, что не позволяет выявить значительную часть ультраструктурных повреждений в сперматозоидах. Наиболее точный метод ультраструктурного анализа для оценки функционального состояния сперматозоидов – метод электронной микроскопии. [10, 13]

Совершенствование протоколов криоконсервации спермы помогло бы преодолеть множество проблем, связанных со снижением качества размороженной спермы. [2]

Цель работы – оценка влияния молекулярного водорода на функциональный статус сперматозоидов быков после криоконсервации с помощью электронной микроскопии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили in vitro в лаборатории ООО «Нижегородское» по племенной работе, Кстовского муниципального района Нижегородской области.

Объект изучения – спермопродукция черно-пестрых голштинизированных быков. Были взяты эякуляты трехлетних быков. Использовали свежеполученное семя с подвижностью сперматозоидов более 7 баллов и минимальным количеством аномальных форм клеток. [3]

Сперму разбавляли стерильной средой BioXcell (Франция). Влияние молекулярного водорода на сперматозоиды изучали путем разведения стерильной среды BioXcell водородной водой. Затем проводили итоговое разбавление, фасовку и эквилибрацию (экспозиция при 4°С в течение 3…4 ч). Замораживали в открытых гранулах. Доза одной открытой гранулы соответствует ГОСТ 26030-2015 и равна 0,2 мл. Сперматозоиды замораживали в течение 7,5 мин. до минус 145°С, затем контейнер с образцами помещали в жидкий азот (минус 196°С).

Эякулят фиксировали раствором глутарового альдегида (2,5%) и осмиевой кислотой (1%), заливали в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Reichert III и просматривали в микроскопе Hitachi SU8220 (Япония).

При электронно-микроскопическом исследовании сперматозоидов анализировали процентное содержание интактных головок, форму ядра, состояние хроматина, положение акросомы, морфологию аксонемы жгутика, ультраструктуру митохондрий.

Для насыщения воды молекулярным водородом использовали герметический бокс, в котором давление водорода повышали до 4 атм. в течение нескольких часов. Затем пакет выдерживали при атмосферном давлении в замкнутом объеме для того, чтобы избежать выделения водорода в виде микропузырьков и его обратной диффузии через стенки пакета. Концентрация молекулярного водорода в растворе находилась в пределах 1,2…1,5 мг/л.

Исследовали нативную сперму, разбавленную BioXcell (группа I), сперму после глубокой заморозки (II), а также сперму после глубокой заморозки, предварительно обработанную молекулярным водородом (III).

Полученные данные анализировали с помощью программы Microsoft Excel. Обработку результатов проводили по параметрическому t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Электронно-микроскопическое исследование нативных сперматозоидов показало, что клетки имели гладкую овальную конфигурацию с выраженной акросомой, занимающей 2/3 передней поверхности головки (см. таблицу). Содержимое акросомы – компактное. Отмечено отсутствие цитоплазматических капелек, дефектов шейки, хвоста. Митохондрии сферической или нитевидной формы. Хроматин представлял собой гомогенную гиалиноподобную массу.

 

Влияние криоконсервации и молекулярного водорода на ультраструктуру сперматозоидов быков

Морфологический признак	Нативные сперматозоиды (группа I)	Сперматозоиды после криоконсервации (группа II)	Сперматозоиды после воздействия молекулярным водородом и криоконсервации (группа III)
Интактная головка	78,85 ±4,67	58,57 ±6,18 *	69,85 ± 5,61 ∆
Нормальная форма ядра	95,57 ±2,29	94,85 ±2,67	94,57 ± 2,63
Нормальное состояние хроматина	94,74 ± 4,06	85,21 ± 4,39 *	90,53 ± 4,27
Нормальная форма митохондрий	95,63 ± 3,17	76,43 ± 4,23 *	84,53 ± 3,43*, ∆
Нормальное строение аксонемы	85,36 ± 5,24	73,42 ± 4,31 *	80,22 ± 5,65
Присутствие акросомы	99,57 ± 4,53	89,57 ± 5,13 *	94,23 ± 4,48
Нормальное положение акросомы	97,32 ± 3,41	91,24 ± 2,39 *	94,54 ± 3,25
Нормальная форма акросомы	90,24 ± 2,24	81,36 ± 2,19 *	86,44 ± 3,12
Компактное содержимое акросомы	85,33 ± 3,37	74,32 ± 3,37	75,44 ± 3,23

Примечание. среднее ± SEM, * – статистически значимые различия по отношению к группе I, р≤0,05; ∆ – статистически значимые различия между группами после криоконсервации (группа II и III), р≤0,05.

 

После криоконсервации наблюдали рост числа клеток с аномалией структуры головки, увеличение количества сперматозоидов с цитоплазматическими капельками. Хроматин был недостаточно конденсированный, содержал фибриллы. Известно, что незрелый хроматин менее устойчив к денатурации. [9] Было повышено содержание сперматозоидов с измененным положением акросомы, у 8,43% клеток отмечена деградация акросомы, в результате преждевременно произошедшей акросомной реакции, у 18,64% сперматозоидов изменена ее форма. Эти изменения ассоциированы с нарушением подвижности. Для осуществления пенетрации сперматозоидом оболочек ооцита необходима интактная акросома, поэтому сведения об ультраструктуре головки и акросомы, а также способы коррекции возникших нарушений, играют важную роль в прогнозировании успешного оплодотворения. [8] Показано, что преждевременная акросомная реакция сперматозоида происходит при повышенном содержании в клетках активных форм кислорода. [7]

Жгутик обеспечивает подвижность сперматозоидов, морфологическая основа активности жгутиков – аксонема. Митохондрии расположены по спирали вокруг аксонемы и передают сперматозоидам энергию. При анализе структуры жгутиков после криоконсервации отмечено, что морфологические изменения затрагивают ультраструктуру аксонемы (нерегулярная укладка митохондрий). Воздействие криоконсервации на ядро сперматозоидов было минимальным.

Добавление молекулярного водорода в среду для разбавления спермы и последующая заморозка не оказали значительного влияния на морфологию клеток после оттаивания. Использование молекулярного водорода в качестве криопротектора способствовало увеличению количества сперматозоидов с интактными головками, имеющими нормальные акросомы, форму и хроматин ядра.

Положительное влияние молекулярного водорода на морфологические признаки сперматозоидов возможно обусловлено его антиоксидантным действием. [8, 10, 11] Известно, что в процессе криоконсервации в сперматозоидах происходит накопление активных форм кислорода, что приводит к повреждению ДНК, белков, липидов, изменению морфологии клетки. [4, 5] Сперматозоиды особенно восприимчивы к повреждению, вызванному окислительным стрессом, поскольку их плазматические мембраны содержат большое количество полиненасыщенных жирных кислот, а цитоплазма – низкие концентрации антиоксидантов. [15]

Таким образом, молекулярный водород можно использовать при криоконсервации спермы, чтобы избежать или минимизировать повреждения сперматозоидов и сохранить целостность спермы. Необходимы дальнейшие исследования в этой области.

Об авторах

Марина Николаевна Иващенко

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского»; ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный агротехнологический университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат биологических наук

 

Россия, г. Нижний Новгород; г. Нижний Новгород

Анна Вячеславовна Дерюгина

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского»

Email: kafedra2577@mail.ru

доктор биологических наук

Россия, г. Нижний Новгород

Михаил Иванович Латушко

Производственное объединение «Уральский оптико-механический завод имени Э.С. Яламова»

Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат технических наук

Россия, г. Екатеринбург

Андрей Александрович Белов

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского»; ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный агротехнологический университет»

Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат биологических наук

Россия, г. Нижний Новгород; г. Нижний Новгород

Павел Сергеевич Игнатьев

Производственное объединение «Уральский оптико-механический завод имени Э.С. Яламова»

Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат физико-математических наук

Россия, г. Екатеринбург

Роман Сергеевич Ковылин

ФГБУН «Институт металлоорганической химии имени Г.А. Разуваева РАН»

Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат химических наук

Россия, г. Нижний Новгород

Алексей Иванович Ерзутов

ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный агротехнологический университет»

Email: kafedra2577@mail.ru

аспирант

Россия, г. Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы