Высокопроизводительное секвенирование микроРНК из ткани аденомы гипофиза и плазмы крови пациентов с акромегалией на платформе Illumina: подготовка образцов и оценка эффективности

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

МикроРНК в тканях и биологических жидкостях рассматриваются как диагностические биомаркеры и терапевтические мишени многих, в том числе онкологических заболеваний. Особую ценность имеют биомаркеры, присутствующие в легкодоступных биологических жидкостях, в первую очередь, в крови. Потенциал микроРНК как предиктивных онкомаркеров и терапевтических мишеней изучают с использованием глобального профилирования, которое обеспечивается секвенированием нового поколения (NGS). NGS обладает высокой чувствительностью, однонуклеотидным разрешением и позволяет одновременно профилировать большое число образцов. Несмотря на многообещающий потенциал микроРНК как биомаркеров и рост числа работ в этом направлении, недостаточно освещенными остаются проблемы, связанные с методами подготовки образцов, спецификой получения библиотек для секвенирования, сложностями количественного анализа. Подготовка библиотек микроРНК для секвенирования имеет определенные трудности и требует подбора условий для каждого типа биологического материала. В настоящей работе подробно описано приготовление библиотек микроРНК из опухолевой ткани аденомы гипофиза и плазмы крови пациентов с акромегалией для секвенирования на платформе Illumina. Рассмотрены сложности и ограничения методов, а также оценена эффективность секвенирования образцов плазмы и мозга. Работа может служить руководством для исследователей, изучающих механизмы регуляции микроРНК при эндокринных заболеваниях гипофиза, а также позволит адаптировать технические процедуры к разным биологическим образцам и разным патологиям.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. В. Игнатьева

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: lefutr@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Е. С. Нерубенко

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: lefutr@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

О. И. Иванова

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: lefutr@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

У. А. Цой

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: lefutr@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Р. И. Дмитриева

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: lefutr@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Iacomino G. (2023) miRNAs: the road from bench to bedside. Genes. 14, 314.
  2. O’Brien J., Hayder H., Zayed Y., Peng C. (2018) Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front. Endocrinol. 9, 402.
  3. Svoronos A.A., Engelman D.M., Slack F.J. (2016) OncomiR or tumor suppressor? The duplicity of microRNAs in cancer. Cancer Res.76, 3666–3670.
  4. Chakrabortty A., Patton D.J., Smith B.F., Agarwal P. (2023) miRNAs: potential as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Genes. 14, 1375.
  5. Lagos-Quintana M., Rauhut R., Yalcin A., Meyer J., Lendeckel W., Tuschl T. (2002) Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Curr. Biol. 12, 735–739.
  6. Si W., Shen J., Zheng H., Fan W. (2019) The role and mechanisms of action of microRNAs in cancer drug resistance. Clin. Epigenetics. 11, 25.
  7. Dai S., Li F., Xu S., Hu J., Gao L. (2023) The important role of miR-1-3p in cancers. J. Transl. Med. 21, 769.
  8. Jurj A., Zanoaga O., Braicu C., Lazar V., Tomuleasa C., Irimie A., Berindan-Neagoe I.A Comprehensive picture of extracellular vesicles and their contents. Molecular transfer to cancer cells. (2020) Cancers. 12, 298.
  9. Li M., Zeringer E., Barta T., Schageman J., Cheng A., Vlassov A.V. (2014) Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosoph. Transact. Royal Soc. B: Biol. Sci. 369, 1652.
  10. Potla P., Ali S.A., Kapoor M. (2020) A bioinformatics approach to microRNA-sequencing analysis. Osteoarthr. Cartil. Open. 3, 100131.
  11. Andrews S. (2010) FastQC – a quality control tool for high throughput sequence data. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
  12. Martin M. (2011) Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17, 10.
  13. Langmead B., Trapnell C., Pop M., Salzberg S.L. (2009) Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25.
  14. Kozomara A., Birgaoanu M., Griffiths-Jones S. (2019) miRBase: from microRNA sequences to function. Nucl. Acids Res. 47(D1), D155–D162.
  15. Liao Y., Smyth G.K., Shi W. (2014) FeatureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30, 923–930.
  16. Ewels P., Magnusson M., Lundin S., Käller M. (2016) MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32, 3047.
  17. Brown R.A.M., Epis M.R., Horsham J.L., Kabir T.D., Richardson K.L., Leedman P.J. (2018) Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnol. 18, 16.
  18. Aryani A., Denecke B. (2015) In vitro application of ribonucleases: comparison of the effects on mRNA and miRNA stability. BMC Res. Notes. 8, 164.
  19. Li Z., Chen D., Wang Q., Tian H., Tan M., Peng D., Tan Y., Zhu J., Liang W., Zhang L. (2021) mRNA and microRNA stability validation of blood samples under different environmental conditions. Forensic Sci. Int. Genet. 55, 102567.
  20. Kondratov K., Kurapeev D., Popov M., Sidorova M., Minasian S., Galagudza M., Kostareva A., Fedorov A. (2016) Heparinase treatment of heparin-contaminated plasma from coronary artery bypass grafting patients enables reliable quantification of microRNAs. Biomol. Detect. Quantif. 8, 9.
  21. Coenen-Stass A.M.L, Magen I., Brooks T., Ben-Dov I.Z., Greensmith L., Hornstein E., Fratta P. (2018) Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biol. 15, 1133.
  22. Yeri A., Courtright A., Danielson K., Hutchins E., Alsop E., Carlson E., Hsieh M., Ziegler O., Das A., Shah R.V., Rozowsky J., Das S., Van Keuren-Jensen K. (2018) Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19, 331.
  23. Androvic P., Benesova S., Rohlova E., Kubista M., Valihrach L. (2022) Small RNA-sequencing for analysis of circulating miRNAs: benchmark study. J. Mol. Diagnostics. 24, 386–394.
  24. Heinicke F., Zhong X., Zucknick M., Breidenbach J., Sundaram A.Y.M., T. Flåm S., Leithaug M., Dalland M., Farmer A., Henderson J.M., Hussong M.A., Moll P., Nguyen L., McNulty A., Shaffer J.M., Shore S., Yip H.K., Vitkovska J., Rayner S., Lie B.A., Gilfillan G.D. (2020) Systematic assessment of commercially available low-input miRNA library preparation kits. RNA Biol. 17, 75–86.
  25. Alotaibi F. (2023) Exosomal microRNAs in cancer: potential biomarkers and immunotherapeutic targets for immune checkpoint molecules. Front. Genet. 14, 1052731.
  26. Kalinina O.V., Khudiakov A.А., Panshin D.D., Nikitin Yu. V., Ivanov A.M., Kostareva A.A., Golovkin A.S. (2022) Small non-coding RNA profiles of sorted plasma extracellular vesicles: technical approach. J. Evol. Biochem. Physiol. 58, 1847–1864.
  27. Petrova T., Kalinina O., Aquino A., Grigoryev E., Dubashynskaya N.V., Zubkova K., Kostareva A., Golovkin A. (2024) Topographic distribution of miRNAs (miR-30a, miR-223, miR-let-7a, miR-let-7f, miR-451, and miR-486) in the plasma extracellular vesicles. Non-Coding RNA. 10(1), 15.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Ассоциация микроРНК hsa-mir-1-3p с заболеваниями человека (согласно данным визуально-аналитической платформы miRNet 2.0).

Скачать (346KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Схема выделения РНК из ткани аденомы гипофиза и плазмы крови пациентов с акромегалией методом фенольной экстракции с использованием реагентов TRIzol®/TRIzol® LS.

Скачать (547KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Анализ суммарной РНК из образцов ткани аденомы гипофиза и плазмы крови пациентов с акромегалией. а, б – Анализ качества РНК, выделенной из ткани опухолей гипофиза пациентов с акромегалией, на биоанализаторе 2100 Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Nano Kit, “Agilent Technologies”). Высококачественная РНК из тканей характеризуется двумя отчетливыми пиками 18S и 28S рРНК (RIN = 7.8–10). в, г – Анализ качества РНК, выделенной из плазмы крови пациентов с акромегалией, на биоанализаторе 2100 Bioanalyzer. РНК фрагментирована и концентрирована в низкомолекулярной области (˂ 200 нуклеотидов, RIN около 2).

Скачать (212KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Схема приготовления библиотеки малых РНК.

Скачать (307KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Анализ библиотек малых РНК из образцов ткани аденомы гипофиза и плазмы крови пациентов с акромегалией. а, б – Электрофореграммы образцов библиотек малых РНК из ткани опухолей гипофиза пациентов с акромегалией, полученные на биоанализаторе 2100 Bioanalyzer. Библиотеки характеризуются множественными пиками. Пик 142 п.н. представляет собой целевой набор фрагментов, содержащих последовательности, соответствующие микроРНК. Пики 65–85 п.н. соответствуют остаточным праймерам. в, г – Электрофореграммы, полученные на биоанализаторе 2100 Bioanalyzer, образцов библиотек малых РНК из плазмы крови пациентов с акромегалией. Пик 146/147 п.н. – целевой набор фрагментов, содержащих последовательности, соответствующие микроРНК, и готовых для высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina. Величины целевого пика и пика 124/125 п.н., содержащего адаптерные последовательности, обратно пропорциональны друг другу.

Скачать (432KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Разделение в полиакриламидном геле (ПААГ) пула библиотек малых РНК и экстракция из геля набора целевых фрагментов ДНК, содержащих последовательности, соответствующие микроРНК. а – Схема электрофоретического разделения в ПААГ пула библиотек малых РНК, полученных из плазмы крови пациентов с акромегалией. Как правило, при электрофорезе в готовом пуле библиотек различаются целевая полоса (около 140 п.н., содержащая фрагменты со вставками, соответствующими микроРНК) и полоса адаптерных димеров (около 120 п.н.). б, в – Пул библиотек микроРНК на электрофореграмме (биоанализатор 2100 Bioanalyzer), полученный путем очистки в ПААГ по протоколу Small RNA-Seq Library Preparation Kit (“Lexogen”). Пик 145/147 п.н. представляет целевой набор фрагментов, содержащих последовательности, соответствующие микроРНК, готовый для высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina. Пики 123/125 п.н. образованы димерами адаптеров. При высоком (более 50%) содержании адаптерных димеров в пуле не обеспечивается эффективное разделение фрагментов в ПААГ, вследствие чего экстрагированная из геля финальная библиотека содержит большое количество конструкций типа линкер-линкер (в).

Скачать (292KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Общая эффективность секвенирования образцов ткани аденомы гипофиза и плазмы крови пациентов с акромегалией. Для оценки эффективности секвенирования рассчитан процент ридов, прошедших фильтрацию при удалении адаптеров и выравнивании. Распределение полученных при секвенировании прочтений показано как средний процент ридов: исключенных после удаления адаптеров; выравненных на известные микроРНК человека (по базе miRBase v22); уникально выравненных на геном в местах, кодирующих микроРНК, по отношению к общему количеству ридов для микроРНК-библиотек из ткани мозга и плазмы. n = 34 для образцов опухоли мозга, n = 23 для образцов плазмы (семь образцов крови здоровых доноров и 16 – пациентов с акромегалией).

Скачать (285KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025